Стиммунол

Иммунизирующие и рострегулирующие эффекты экзогенных аминокислот

Т.А. Рябчинская, И.Ю. Бобрешова, Г.Л. Харченко, Н.А. Саранцева

Федеральное государственное научно учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений» (Воронежская обл., п. Рамонь)

Представлены данные о сигнальной роли различных аминокислот, обусловливающей иммунизирующее и рострегулирующее действие экзогенных аминокислот в ультрамалых дозировках при предпосевной обработке семян ярового ячменя.

 ВВЕДЕНИЕ 

Аминокислоты являются основными структурными единицами, из которых построены молекулы белковых веществ, поэтому они играют огромную роль в жизнедеятельности всех живых организмов. Они также присутствуют в клетках растений в свободном состоянии, и количество видов АК исчисляется сотнями (1). Экзогенное дополнительное внесение их вызывает определенное воздействие на растительные организмы. Так, метионин способствует снижению полегаемости злаков, влияет на длину колоса и количество формирующихся зерен в них (2). Некоторые производные глицина обладают ингибирующим, ретардантным и дефолиирующим действием на растения хлопка, сои и сахарной свеклы (3). Отмечены рострегулирующие свойства пролина (4). Он увеличивает фертильность пыльцы, а также участвует в регуляции водного баланса клеток и тканей (5-7), способствует повышению теплоустойчивости растений (6), то есть является полифункциональным протектором. В настоящее время пролин рассматривается как фактор неспецифических механизмов устойчивости растений и адаптации к стрессорам (8). Структурные особенности пролина дают основание считать его одним из возможных скавентеров активных форм кислорода, а также антиоксидантом (9). Кроме того, данная АК участвует в работе системы клеточного рН-стата и является источником энергии (8).

 Антиоксидантные свойства проявляют в той или иной степени некоторые другие аминокислоты: аргинин, гистидин, цистеин и др. (10). В стрессовых условиях свободные АК могут оказывать влияние на работу белоксинтезирующего аппарата (11). Отдельные АК могут принимать участие в регуляции метаболизма, влияя на эффективность работы фитогормонов. Так, аланин способен конъюгироваться с цитокининами (12). 
     В последние годы обсуждается вопрос о регуляторном значении свободных аминокислот (Рябушкина, 2005,Радюкина и др., 2008). Известно, что низкомолекулярные азотсодержащие соединения, образующиеся при стрессовых состояниях растений,  сами могут выполнять роль сигналов, которые вызывают изменения в экспрессии генов, в том числе связанных с адаптивным ответом (Колупаев, Карпец, 2010). Cвободные аминокислоты участвуют в построении пептидов, производных сигнальных белков, обладающих ферментативной активностью. В свете современных знаний молекулярные механизмы действия пептидов на функциональные свойства клеток могут быть представлены тремя путями. Во-первых, эти пептиды конкурируют с гомологичными им полноразмерными ферментами за связывание с другими  сигнальными белками, которые выполняют регуляторные функции. Во-вторых, действие пептида в клетке может проявляться  во взаимодействии с комплементарными участками фермента, производным которого он является, что изменяет его каталитическую активность и функциональное действие. И третий механизм заключается во влиянии пептида на стабильность межмолекулярных  комплексов между сигнальными белками, что также вызывает изменения в клетках. 
 Различные механизмы могут функционировать согласованно, поскольку в их основе лежат конкурентные отношения между пептидом и соответствующим ему участком за связывание с белком-партнером или с комплементарными участками гомологичного ему белка. Выбор механизма или их комбинации зависит от природы и функций сигнального белка, производным которого является пептид, местоположения гомологичного пептиду участка сигнального белка, от микроокружения белка и его  функционального состояния (Шпаков, 2111).

В настоящее время сигнальные регуляторные функции низкомолекулярных соединений (в том числе и аминокислот) остаются еще недостаточно изученными 

В ФГНУ «ВНИИЗР» был разработан новый полифункциональный фитоактиватор на основе почвенных олигохет – Стиммунол. В комплексе органических компонентов препарата обнаружено 17 аминокислот, содержание которых колеблется по различным видам АК в пределах 0,1-2,5%. Если предположить, что данные органические соединения являются действующими веществами препарата, то их роль может быть оценена только как сигнальная, поскольку препарат оказывает действие на растения в крайне низких дозировках (нормы расхода препарата при обработке семян составляют от 0,5 до 5 мл/т, при обработке вегетирующих растений – от 5 до 10 мл/га). Для проверки данной гипотезы в лабораторных условиях исследовали характер действия отдельных химически чистых АК на проростки ячменя после предпосевной обработки семян в концентрациях, близких к количественному содержанию их в препарате Стиммунол.

Материалы и методы

Полифункциональное действие (иммунизирующее, фунгистатическое, рострегулирующее) аминокислот изучали в лабораторных условиях «рулонным» методом, практикуемым для фитоэкспертизы семян (15). Обработка семян ячменя (сорт Турингия) проводилась путем встряхивания в стеклянных сосудах, в которые вносился рабочий раствор (АК в определенной дозировке, из расчета нормы расхода на 1 т семян и рабочей жидкости – 10 л/т семян). Шкала дозировок распределялась при двукратном снижении от предыдущей. Оценивали влияние на состояние проростков ячменя следующих АК: L-валин, L-пролин, L-изолейцин, L-глицин, L-фенилаланин, L-аргинин, L-глутамин.

Фунгистатическое (иммунизирующее) действие АК на проростки оценивали визуально по биологической эффективности (БЭ), то есть по снижению развития (распространенности) заболеваний на поверхности семян и проростков на 7 день после обработки в сравнении с контрольным вариантом (дистиллированная вода). Повторность вариантов опыта – трехкратная, в повторности – 100 семян. Учитывали следующие заболевания: гельминтоспориоз и фузариоз, возбудителями которых являются биотрофные микромицеты (Helminthosporium sativum P., K. et B. и Fusarium spp.), а также оценивали степень распространенности на проростках некротрофных грибов рода Mucor. Последние, хотя и не имеют практического значения, но в лабораторных экспериментах распространенность их бывает достаточно высокой, и существенно различающейся в вариантах опыта, что дает основание к анализу иммунных реакций растений по отношению к данным возбудителям.

Рострегулирующие эффекты действия АК определяли при измерении длины ростков, колеоптилей, массы ростков и корешков и сравнении их с показателями в контроле (%). Результаты опытов обрабатывали на ПК с использованием методов биометрической статистики и программы Excel.

Результаты и обсуждение

Оценка действия экзогенного внесения микроколичеств пролина в растения ячменя при обработке семян показала, что по отношению к различным фитопатогенам иммунизирующая активность его изменялась в зависимости от использованной дозировки. Существенных математических зависимостей между исследуемыми показателями выявлено не было. Однако прослеживается обратная тенденция изменения БЭ относительно фузариоза и мукороза в зависимости от дозировки (рис. 1а).

Рис. 1. Фунгистатическое (иммунизирующее) и рострегулирующее действие различных аминокислот на проростки ячменя в зависимости от дозировки при нанесении на семена

При высоком инфекционном фоне (в контроле развитие гельминтоспориоза 35,1%; распространенность фузариоза – 9,8%, мукороза – 71,8%) наибольший фунгистатический эффект по отношению к биотрофным возбудителям наблюдался при норме расхода пролина 0,108 г/т, а к некротрофному – в более высокой дозировке – 0,432 г/т. При этом более высокая иммунизирующая активность относительно биотрофов сопровождалась снижением активности ростовых процессов: масса одного растения по отношению к контролю существенно (на 8%) снизилась. Фунгистатические свойства пролина обусловлены его непосредственным участием в работе протекторных систем растений (14). 

Иммунизирующее действие изолейцина по отношению к биотрофным грибам р. Fusarium проявилось только при обработке семян более высокими дозировками (0,07 и 0,28 г/т), причем резкий спад БЭ отмечался в варианте с применением нормы – 0,14 г/т (рис. 1 б). Такие криволинейные зависимости фунгистатической активности различных регуляторов роста от используемых дозировок всегда наблюдались нами при изучении данного вопроса (6, 7).

В отличие от действия пролина, прослеживается, прямая, хотя и слабая, корреляционная связь (r = 0,42) иммунных реакций растений по отношению к возбудителям заболеваний разного типа (гельминтоспориоз – биотрофный, мукороз – некротрофный тип). Достоверное увеличение ростовой активности (массы проростков) отмечено было только при использовании одной дозировки – 0,035 г/т. Также выявлена тенденция снижения ростовой активности проростков в дозировке 0,07 г/т, вызывающей максимальный иммунизирующий эффект (фузариоз).

При анализе действия на растения глицина в результате ультрамалого нанесении его на семена существенных математических зависимостей между исследуемыми показателями выявлено не было, однако на графике (рисунок 1 в) прослеживается тенденция противоположных индуцированных иммунных реакций растений по отношению к разным типам патогенов. Рострегулирующая активность различных микродоз глицина в основном находилась в пределах ошибки опыта. Существенное увеличение массы растений относительно контроля на (4,5%) отмечено только при норме расхода данной АК 0,021г/т.

Иной характер действия на растения отмечен у валина. В отношении фузариоза иммунизирующего действия на растения валин не оказал даже при слабой распространенности данного микромицета. Однако на высоком инфекционном фоне гельминтоспориоза (30,2%) и грибов р. Mucor (78,2%) проявилась четкая прямая отрицательная корреляционная зависимость между БЭ и дозировками данной АК (r = -0,74) или сложная криволинейная зависимость (R2 = 0,89) (рис. 2 а, б).

Рис. 2. Зависимости фунгистатической и рострегулирующей активности валина от дозировки при обработке семян ячменя

Существенное увеличение ростовой активности (масса растений по отношению к контролю 104,6%) отмечено было только при максимальной дозировке валина. Установлены также существенные криволинейные зависимости между рострегулирующей и иммуноиндуцирующей активностью валина в отношении гельминтоспориоза и мукороза (рис. 2 в, г). 

При обработке семян глутамином также выявлены четкие зависимости иммунизирующей и рострегулирующей активности от вида грибного патогена и используемой дозировки АК (рис. 3).

Рис. 3. Зависимости фунгистатической и рострегулирующей активности глутамина от дозировки при обработке семян ячменя

Однако, в отличие от большинства исследованных АК, между уровнем иммунизации проростков различными дозировками глутамина относительно двух типов микопатогенов не отмечено существенной прямолинейной корреляционной зависимости (r = 0,38) при наличии слабой криволинейной (полином 3 степени, R2 = 0,747). При этом рострегулирующая активность данной АК относительно контроля существенно увеличивалась во всех используемых дозировках (увеличение к контролю на 6,1-8,9%). Отмечена сильная криволинейная (полином третьей степени) зависимость между ростовой активностью (масса растений) и дозировками глутамина (R2= 0,997), а также прямолинейная связь между ростовой и иммунизирующей активностью по отношению к мукорозу (R2 = 0,999). 

 Характер действия на растения микродоз экзогенного аргинина при нанесении на семена ячменя отличался от других изучаемых АК. На слабом инфекционном фоне фузариоза (развитие в контроле 1%) индукция иммунных реакций по отношению к данному возбудителю резко изменялась в зависимости от нормы расхода АК в пределах значений биологической эффективности от 9 до 100% (рис. 4 а).

Рис. 4. Иммунизирующие и ростовые эффекты ультрамалых дозировок аргинина при предпосевной обработке семян ячменя

Минимальный эффект имела дозировка 0,0098 г/т. Выявлена четкая криволинейная зависимость между биологической эффективностью АК в отношении гельминтоспориоза и дозировкой аргинина (рисунок 4 б). Данная АК имела наибольшее влияние на ростовые процессы в растениях, увеличение массы проростков достигало 6-11%. При этом наблюдались существенные криволинейные зависимости ростовой активности АК в зависимости от ее дозировки (рисунок 4 в). Существенная криволинейная связь выявлена и между биологической эффективностью аргинина в отношении гельминтоспориоза и его ростовой активностью (рисунок 4 г). 

При анализе действия на проростки ячменя фенилаланина установлена сильная отрицательная корреляционная связь (r = -0,94) между иммунизирующей активностью АК в отношении фитопатогенов с разным механизмом паразитизма (Helminthosporium и Mucor) (рис. 5 а).

Рис. 5. Фунгистатическое (иммунизирующее) и рострегулирующее действие экзогенного фенилаланина на растения ячменя при нанесении на семена

Участие данной АК в сигнальной системе клеток растений может быть связано с основным путем (фенилпропаноидный) синтеза салициловой кислоты, которая выполняет с одной стороны роль элиситора, с другой – фитогормона. В этом случае фенилаланин является ее прямым предшественником (18). Рострегулирующая и иммунизирующая активность фенилаланина (в отношении мукороза) находились в сильной корреляционной криволинейной зависимости (R2 = 0,99), характеризующейся обратными тенденциями (рис. 5 б). 

В таблице представлен сравнительный анализ различных эффектов действия экзогенных АК, взятых в дозировках, обеспечивающих максимальное иммунизирующее действие в отношении основного наиболее вредоносного патогена всходов ячменя – гельминтоспориоза. Из всех проанализированных АК наибольший иммуностимулирующий эффект на достаточно высоком инфекционном фоне гельминтоспориоза (развитие в контроле 34,5%) показал глутамин,
который обладал и высокими рострегулирующими свойствами. 

Таблица. Сравнительная эффективность АК при оптимальных иммуностимулирующих дозировках (по гельминтоспориозу)

Примечание: * – различия существенны при Р05

Проследить иммунные реакции растений по отношению к фузариозу из-за очень низкого инфекционного фона удалось только для отдельных аминокислот, среди которых наибольший эффект показали пролин, аргинин и изолейцин (последний – в более высокой дозировке) (рис. 1, 4).

Наибольшее снижение распространенности мукоровых грибов на проростках ячменя наблюдалось при воздействии глутамина и изолейцина (последний – в более высокой дозировке). Существенно повышали активность ростовых процессов глутамин во всех дозировках и аргинин – в наиболее высокой норме расхода (0,039 г/т), при этом увеличение массы растений достигалось за счет резкого усиления роста корневой системы.

При смешивании различных АК в разных комбинациях и дозировках наблюдалось изменение характера действия их на растения ячменя. Как правило, фунгистатическое и рострегулирующее действие смесей АК не превышало эффекты, установленные при самостоятельном использовании отдельных АК, что объясняется их синергическим или ингибирующим взаимовлиянием на отдельные процессы жизнедеятельности растений.

Таким образом, в результате лабораторных исследований выявлено существенное влияние некоторых экзогенных аминокислот при обработке семян в микродозировках на различные физиологические проявления жизнедеятельности растений ячменя уже в первых фазах их развития. Аналогичное действие на растения оказывали также присутствующие в биопрепарате Стиммунол некоторые углеводы и полиамины карбоновых кислот. Это может быть свидетельством сигнального (элиситорного) действия данных природных органических соединений. Можно предположить, что воспринимаемые определенным образом как слабые элиситорные сигналы данные биологически активные вещества, внедряясь в информационные сети растений по различным путям, вызывают соответствующие изменения в балансе фитогормонов, а также в системах, формирующих программу защитных реакций растений от фитопатогенных микроорганизмов. Причем, формирование величины и характера ответной реакции на сигнал, связанной как защитными функциями, так и с ростовыми процессами, находится в тесной зависимости от силы воспринимаемого сигнала (дозировки АК), вида патогенного организма и типа взаимоотношений его с растением-хозяином.
Многокомпонентность препарата Стиммунол, содержащего большое количество природных биостимуляторов, обеспечивает их взаимозаменяемость в различных условиях среды, полифункциональность и особый характер действия фитоактиватора. При применении его на различных сельскохозяйственных культурах в разных нормах расхода фунгистатическое (иммунизирующее) действие в отношении отдельных фитопатогенов и их комплексов составляло от 20 до 80%. За счет снижения потерь от вредных объектов и комплекса положительных воздействий на растения (усиление ростовой активности, активизация фотосинтетических процессов, увеличение репродуктивных показателей) прибавка урожая составляла от 12-28% – на зерновых культурах и сахарной свекле, до 40-60% – на картофеле и многолетних бобовых травах (Алёхин и др., 2010). Отмечалось усиление эффективности Стиммунола в условиях действия стрессовых факторов, что свидетельствует о его антидепрессантных свойствах.
Длительная сопряженная с другими компонентами биоценозов и в целом биосферой эволюция растений привела к организации очень сложной сигнальной системы управления всеми процессами их жизнедеятельности, запуск которой осуществляется при воздействии чрезвычайно низких концентраций различных природных органических веществ. Познание механизмов работы сигнальных систем растений в будущем позволит выйти на новый экологически безопасный уровень управления фитосанитарным состоянием агробиоценозов и продуктивностью сельскохозяйственных культур.

 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 

1. Гудвин Т. Введение в биохимию растений. М.: Мир. 1986. Т.1. 392 с.

2. Патент 62-164603 IP. МКИ A01N 33/12. Опубл. 21.07.87

3. Патент 131833 DD. МКИ AO1N 5/00. Опубл. 26.07.78

4. Троян В.М., Безвелюк З.А. Применение пролина для регуляции роста и развития растений // Регуляторы роста растений. Киев, 1992. С. 124-128.

5. Колупаев Ю.Е., Карпец Ю.В., Акинина Г.Е. Влияние салициловой кислоты и перекиси водорода на содержание пролина в колеоптилях пшеницы при тепловом и солевом стрессах / Ю.Е. Колупаев // Вісн. Харків. націон. аграрн. ун-ту. Сер. Біологія. 2005. Вип. 1 (6). С. 51-56.

6. Naidu B.R., Jones G.P., Paleg L.G. et al. Proline ana-logues in melaleuca species: response of Melaleuca lanceolata and M. uncinata to water stress and salinity // Austral. J. Plant Physiol. 1987. V. 14. P. 669-677.

7. Paek K.Y., Chandler S.F., Thorpe T.A. Physiological effects of Na2SO4 and NaCl on callus cultured of Brassica campestris // Physiol. Plant. 1988. V. 72. P. 160-166.

8. Кузнецов В.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль, метаболизм, регуляция // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 2. С. 321-336.

9. Радюкина Н.Л., Шашукова А.В., Шевякова Н.И., Кузнецов В.В. Участие пролина в системе антиоксидантной защиты у шалфея при действии NaCl и параквата // Физиология растений. 2008. Т. 55 № 5. С. 721-730.

10. Larson R.A. The antioxidants of higher plants // Phyto-chemistry. 1988. V. 27. P. 969-978.

11. Perez-Sala D., Parrilla R., Ayuso M.S. Key role of alanine in the control of hepatic protein synthesis // Biochem. J. 1987. V. 241. P. 491-497.

12. Zhang R., Hocart C.H., Letham D.S. Inhibitors of cytokinin metabolism // J. Plant Growth Regul. 1989. V. 8. P. 327-339.

13. Рябушкина Н.А. Синергизм действия метаболитов в ответных реакциях растений на стрессовые факторы // Физиология растений. 2005. Т. 52. № 4. С. 614-621.

14. Колупаев Ю.Е., Карпец Ю.В. Участие растворимых углеводов и низкомолекулярных соединений азота в адаптивных реакциях растений // Вісн. Харків. націон. аграрн. ун-ту. Серiя Бiологiя. 2010. В. 2 (20). С. 36-53.

15. Система применения протравителей на основе экспресс-методов фотоэкспертизы семян. М., 1995. С. 5-16.

16. Рябчинская Т.А., Харченко Г.Л., Саранцева Н.А., Бобрешова И.Ю., Злотников А.К. Полифункциональное действие препарата Альбит при предпосевной обработке семян яровой пшеницы // Агрохимия. 2009. № 10. С. 39-47.

17. Рябчинская Т.А., Харченко Г.Л., Бобрешова И.Ю., Саранцева Н.А., Злотников А.К. Особенности полифункционального действия биопрепарата Альбит при обработке семян // Сахарная свекла. 2009. №10. С. 29.

 18. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. Уфа: Гилем, 2001. 160

19. Шпаков А.О. Использование пептидной стратегии для изучения функций
и структуры сигнальных белков с ферментативной активностью. / Цитология, 53, 8,
2011, с. 633-642.

20. Алёхин В.Т., Рябчинская Т.А., Бобрешова И.Ю., Харченко Г.Л., Саранцева Н.А. Новый препарат для стимуляции иммунитета и повышения продуктивности растений // Защита и карантин растений. 2010. № 3. С. 44-46.